分光蛍光光度計の基礎（5） 分光蛍光光度計の注意事項

分光蛍光光度計を用いて測定を行う際には、幾つか注意すべき点があります。ここでは、その例を紹介します。

励起波長(吸収波長)と蛍光波長が近い試料では、試料濃度の増加に伴い試料からの蛍光を試料自身が再吸収する「自己吸収(内部遮蔽効果の一つ)」と呼ばれる現象が生じます。例えば、硫酸キニーネ溶液の場合、図1のように励起スペクトルの波長帯と蛍光スペクトルの波長帯に重なりがあり、高濃度になると試料自身がその波長帯の蛍光を吸収するため、図2のように低濃度とは異なる蛍光スペクトル形状を示します(形状を比較するため、強度は規格化しています)。

一般に、蛍光物質は温度の上昇とともに溶媒の運動、衝突によって熱的に失活するため蛍光強度が減少します。そのため、蛍光測定では吸光測定以上に温度の管理が重要です。

蛍光測定に用いる試薬や溶媒の純度が低い場合、不純物が試料からの蛍光を吸収したり、不純物が試料と反応したりすることで消光するケースがあります。

分光光度計の縦軸が、ベースライン補正による100 %の基準を持つのに対して、蛍光はゼロからの増加分を測定しているため、縦軸の基準がありません。従って、検出される蛍光強度は試料本来の蛍光強度と装置固有の波長特性の積になります。そのため、試料の真のスペクトルを求めるためにはスペクトル補正を行い、観測されたスペクトルから装置固有の波長特性を除去することが必要となります。