技術情報 Web基礎セミナー 分光蛍光光度計の基礎(5) 分光蛍光光度計の注意事項
分光蛍光光度計の基礎

分光蛍光光度計の基礎(5) 分光蛍光光度計の注意事項

分光蛍光光度計を用いる測定には、幾つか注意すべき点があります。今回は、その例を紹介します。

消光現象

溶存酸素による消光
ナフタリン、アントラセンなどの蛍光物質は、溶存酸素によって蛍光強度の低下が見られ、再現性の良いデータが得られません。そのため、N2ガス置換や真空脱気を用いて溶存酸素の影響を取り除き、測定する必要があります。

溶存酸素による消光
図1 溶存酸素による消光
温度消光
一般に、蛍光物質は温度の上昇とともに蛍光強度が減少します。そのため、蛍光測定では吸光測定以上に温度の管理が必要です。

濃度消光
ほとんどの蛍光物質は高濃度になると、蛍光強度が減少します。内部遮断と類似していますが、そのメカニズムは異なっており、分子間の相互作用による影響といわれています。プソイドシアニン水溶液のように、高濃度のときだけ、蛍光を発する物質もあります。

濃度消光
図2 濃度消光
不純物による消光
蛍光測定に用いる試薬や溶媒の純度が低い場合、不純物が試薬と反応して消光することで分析値を不正確にするケースもあります。

内部遮蔽(自己吸収)

分光蛍光光度計は、試料溶液の濃度が大きいと励起光がセル表面で強く吸収されて、セル中央部まで充分到達しなくなります。これを内部遮蔽効果といい、濃度の高い溶液のスペクトルは希薄溶液時のスペクトルに対して大きくゆがめられます。
例えば、硫酸キニーネの吸収極大波長は350nmであり、希薄溶液のスペクトル励起スペクトルも350nmにピークトップを持ちます。ところが、濃厚溶液にすると、最適励起波長である350nmの光はほとんどセル内部に到達しなくなるため、発光強度が極小値となり、希薄溶液時と全く異なる励起スペクトルが得られます(図3)。
硫酸キニーネ溶液の励起スペクトル
図3 硫酸キニーネ溶液の励起スペクトル(蛍光モニタ波長: 450nm)
つまり、濃厚溶液は、発光に必要な励起源となる波長の光を自らが強く吸収するため、最適励起波長の透過率が低くなります。このように濃厚溶液の励起スペクトルは、希薄溶液の励起スペクトルに濃厚溶液の透過スペクトルを乗じた形状になります(図4、5)。
重ねがき
図4 硫酸キニーネ溶液の励起スペクトルと透過スペクトルの重ね書き(縦軸ノーマライズ)
濃厚溶液
図5 濃厚溶液の励起スペクトルの算出(硫酸キニーネ溶液)

スペクトル補正

分光光度計の縦軸が、ベースライン補正による100%の基準を持つのに対して、蛍光はゼロからの増加分を測定しているため、基準がありません。従って、検出される蛍光強度は試料正味の蛍光強度と装置関数の積になります。そのため、試料の真のスペクトルを求めるためにはスペクトル補正を行い、観測されたスペクトルから装置関数を除去することが必要となります。詳しくは、FP-8000seriesの取扱説明書を参照してください。
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