技術情報 Web基礎セミナー HPLCの基礎(1) HPLCとは?
HPLCの基礎

HPLCの基礎(1) HPLCとは?

HPLCの略

HPLCとは、
H(High)、P(Performance)、L(Liquid)、C(Chromatography)の略で、
直訳すると高効率液体クロマトグラフィー、日本語名で高速液体クロマトグラフィーと言います。
ちなみに、クロマトグラフィーは測定法、クロマトグラムは測定結果、クロマトグラフは装置を指します。

分離分析とは

分離分析とは、ある物質に含まれる成分を成分ごとに分けて、定性、定量分析を行うものです。
定性分析とは、「各成分がどんな化合物なのか?」
定量分析とは、「各成分がどれくらいの量(濃度)なのか?」
を調べることをいいます。
分離分析の内容
図1 分離分析とは

クロマトグラフィーのはじまり

混合物を分離する方法として、ろ過、蒸留、抽出などの方法があります。クロマトグラフィーはロシアの植物学者tswettにより発明されました。tswettは1900年代の初めに、立てた管に炭酸カルシウムをつめ、上部に植物から抽出した色素を置き、石油エーテルという溶媒を流しました(図2)。すると、管の中で光がプリズムで7色に分かれるように色素が色の帯となって現れました。このことから、tswettはこの分離方法をギリシャ語のクロマト(色)、グラフ(記録)という単語を使い、クロマトグラフィーと名付けました。
HPLCはカラムクロマトグラフィーと呼ばれる分離法の一種で、常圧下に比べ高圧にすることで短時間に分離分析できるように発展させた技術です。
tswettのクロマトグラフィー
図2 tswettのクロマトグラフィー

分離機構

混合物を移動相と呼ばれる液体(図2では石油エーテル)の流れにのせ、固定相と呼ばれる固体もしくは液体の媒質(図2では炭酸カルシウムの粉末)の中を移動させます。混合物に含まれる成分は移動相の流れとともに、固定相と相互作用しながら移動相と共に移動します。このとき、各成分と固定相との相互作用の強さが異なると強く相互作用する成分はゆっくりと移動し、弱く相互作用する成分は速く移動します。HPLCは、試料を溶かした溶液を移動相の流れにのせて固定相(カラム)を通過させ、通過する速度の違いを利用して成分を分離します。測定対象となる試料は、成分ごとに充填剤との相互作用の強さが異なるため、カラムの中を進む速さが違ってくるわけです。
HPLCの分離機構
図3 クロマトグラム(左)と分離機構(右)

クロマトグラムが得られる理由

分離された成分は検出器で検出します。例えば、UV検出器の場合はUV吸収のある成分を検出できます。各成分の信号は溶出時間ごとに得られ、X軸を時間、Y軸を信号強度としてプロットすることでクロマトグラムが得られます。測定条件が同じであれば、標準試料(成分が分かっている試料)の溶出時間(ピーク位置)と未知試料の溶出時間を比較することで、成分の同定ができます。また、吸収の強さは濃度に比例するので、標準試料で検量線を作成したのち、ピーク面積、または高さを測定することで成分の定量ができます。
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